酶聯免疫法基本原理及注意事項

　　酶聯免疫法基本原理及注意事項

　　這類反應的定性結果可以用肉眼判斷。目視標本也無色或近于無色者判為陰性，顯色清晰者為陽性。但在ELSIA試劑盒中，正常人血清反應后常可出現呈色的本底，此本底的深淺因elisa試劑盒的組成和實驗的條件不同而異，因此實驗中必須加測陰性對照。陰性對照的組成應為不含受檢物的正常血清或類似物(見3.6)。在用肉眼判斷結果時，更宜用顯色深于陰性對照作為標本陽性的指標。此時酶催化無色的底物生成有色的產物。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當提高溫度有助于加速顯色進行。在定量測定中，加入底物后的反應溫度和時間應按規定力求準確。ELISA試劑盒定性測定的顯色可在室溫進行，時間一般不需要嚴格控制，有時可根據陽性對照孔和陰性對照孔的顯**況適當縮短或延長反應時間，及時判斷。

　　OPD底物顯色一般在室外溫或37℃反應20-30分鐘后即不再加深，再延長反應時間，可使本底值增高。OPD底物液受光照會自行變色，顯色反應結束時加入終止液終止反應。OPD產物用硫酸終止后，顯色由橙黃色轉向棕黃色。

　　TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應觀察結果。但為保證實驗結果的穩定性，宜在規定的適當時間閱讀結果。TMB經HRP作用后ELISA試劑盒，約40分鐘顯色達，隨即逐漸減弱，ELISA試劑盒至2小時后即可*消退至無色。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉(SDS)等酶抑制劑均可使反應終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間(12-24小時)不褪，是目視判斷的良好終止劑。此外，各類酸性終止液則會使藍色轉變成黃色，此時可用特定的波長(450nm)測讀吸光值。

　　①使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。

　　②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標本(測定其中的抗體或抗原)和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據顏色反應的深淺來進行定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。

　　BUNSEN本生ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑：

　　①固相的抗原或抗體

　　②酶標記的抗原或抗體

　　③酶作用的底物。根據試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具備條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。

　　BUNSEN本酶聯免疫法注意事項：

　　⒈正式試驗時，應分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件，待檢樣品應作一式二份，以保證實驗結果的準確性。有時本底較高，說明有非特異性反應，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。

　　⒉在ELISA中，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括：

　　⑴固相載體的選擇：許多物質可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。當前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進行反應，觀察其顯色反應是否均一性，據此判明其吸附性能是否良好。

　　⑵包被抗體(或抗原)的選擇：將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時，要求純度要好，吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響，一般多采用4℃18～24小時。蛋白質包被的適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質濃度(0.1、1.0和10μg/ml等)進行包被后，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標本的OD值。選擇OD值而蛋白量少的濃度。對于多數蛋白質來說通常為1～10μg/ml。

　　⑶酶標記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定(見酶標記抗體部份)。然后再固定其它條件或采取“方陣法"(包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實驗系統里準確地滴定其工作濃度。

　　⑷酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應，而本身無色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用，應注意防護。有條件者應使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是當前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間后，應加入強酸或強堿以終止反應。通常底物作用時間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。

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