糖原磷酸化酶 a(GPa)活性檢測試劑盒

　　糖原磷酸化酶 a(GPa)活性檢測試劑盒

　　微量法

　　規格：100T/96S

　　產品內容：使用請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系工作人員。

　　試劑名稱 規格 保存條件

　　提取液 液體 110mL×1 瓶 2-8℃保存

　　試劑一 液體 20mL×1 瓶 2-8℃保存

　　試劑二 粉劑×1 支 2-8℃保存

　　試劑三 粉劑×1 支 2-8℃保存

　　試劑四 粉劑×1 支 -20℃保存

　　試劑五 粉劑×2 支 -20℃保存

　　試劑六 粉劑×2 支 -20℃保存

　　溶液的配制：

　　1、 試劑二：臨用加入 0.5 mL 蒸餾水，充分混勻;

　　2、 試劑三：臨用加入 0.5 mL 蒸餾水，充分混勻;可分裝后-20℃保存 4 周，避免反復凍融;

　　3、 試劑四：臨用加入 1.25 mL 蒸餾水，充分混勻;可分裝后-20℃保存 4 周，避免反復凍融;

　　4、 試劑五：臨用取一支加入 1 mL 蒸餾水，充分混勻;可分裝后-20℃保存 4 周，避免反復凍融;1 瓶粉劑即可做 100T，為延長使用時間，故多給一支。

　　5、 試劑六：臨用取一支加入 1 mL 蒸餾水，充分混勻;可分裝后-20℃保存 4 周，避免反復凍融;1 瓶粉劑即可做 100T，為延長使用時間，故多給一支。

　　6、 工作液的配制：臨用根據實驗所需用量，按照試劑一：試劑二：試劑三：試劑四：蒸餾水=148μL:4μL: 4μL: 4μL: 10μL(1T 的量)的比例，充分混勻，現用現配。

　　產品說明：

　　糖原磷酸化酶是糖原分解代謝中的關鍵酶，催化糖原的磷酸化反應。該酶分為有活性的糖原磷酸化酶 a

　　(Glycogen phosphorylase a, GPa)和無活性的糖原磷酸化酶 b(Glycogen phosphorylase b, GPb)兩種形式。糖原的分解主要在糖原磷酸化酶 a 的催化下進行。未添加激活劑時，糖原磷酸化酶 a 催化糖原和無機磷產生葡萄糖殘基生成糖原和 1-磷酸葡糖，磷酸葡萄糖變位酶和 6-磷酸葡萄糖脫氫酶進一步依次催化 NADP 還原生成 NADPH，在 340nm 下測定 NADPH 上升速率，即可反映糖原磷酸化酶 a 活性。

　　注意：實驗之建議選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

　　需自備的儀器和用品：

　　紫外分光光度計/酶標儀、低溫離心機、恒溫培養箱/水浴鍋、研缽/勻漿器、可調式移液器、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、冰和蒸餾水。

　　操作步驟：

　　一、樣本處理(可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻)

　　1、組織：按照組織質量(g)︰提取液體積(mL)為 1︰5~10 的比例(建議稱取約 0.1 g 組織，加入 1 mL 提取液)進行冰浴勻漿，然后 8000 g，4℃，離心 10 min，取上清置于冰上待測。

　　2、細菌或者細胞：先收集細胞或細菌樣本到離心管內，棄上清，按照每 500 萬細胞或細菌加入 1mL 提取液，超聲波破碎細菌或細胞(功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次)。8000g，4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

　　3、血清(漿)：直接檢測

　　二、測定步驟

　　1、 紫外分光光度計/酶標儀預熱 30 min 以上，調節波長至 340 nm，分光光度計蒸餾水調零。

　　2、 臨用工作液置于 37℃預熱 5min。

　　3、 在微量石英比色皿或 96 孔 UV 板中依次加入 10 μL 樣本、10 μL 試劑五、10 μL 試劑六、170 μL 工作液，充分混勻 10s，記錄 340nm 處 10s 時吸光值 A1，37℃水浴鍋或者恒溫培養箱反應 10min(酶標儀有控溫功能的可以調節溫度至 37℃)，反應后拿出迅速擦干測定 10min10s 時吸光值 A2。計算 ΔA=A2-A1。

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